疫苗生产中为什么要重点考虑培养基问题？

用户：针对于疫苗生产的培养基设计，我们应该考虑什么？

金源康：这也是培养基开发和生产过程中面临最重要的问题。

疫苗生产核心要素，主要包括以下内容：①细胞系/病毒株；②培养基；③细胞培养技术和病毒纯化技术；④生物反应器等等。其中细胞系和培养基的匹配尤为重要。本文也着重从这两个方面来介绍。

细胞库的建立

细胞是生产之本，是病毒增殖的场所，合理建立种细胞库和生产细胞库是疫苗生产企业的根本。图一为BHK-21细胞用于口蹄疫疫苗生产种细胞库建立和使用基本流程图。细胞库一般分为种细胞库、附属细胞库和工作细胞库。工作细胞库需要定期更换，这样才能更好的适应病毒敏感性和生产的延续性。其中种细胞库也要进行各个方面的检测，包括：无菌检测、复苏活力检测、支原体检测、外源病毒检测和FMDV敏感性的检测等。只有这些指标正常，才能更好应用于生产。这只是BHK-21细胞应用于口蹄疫的一个例子，其他疫苗生产也是类似的过程。

图一：BHK-21细胞用于口蹄疫疫苗生产种细胞库建立和使用基本流程图(Radlett，1987)。

培养基设计思路

在疫苗生产中，细胞培养只是一个中间环节，最终的目的是为了得到更多更完整的病毒或者抗原。那么，一个细胞能产出多少病毒？也是制约产量的关键。影响细胞病毒产量的因素有很多，具体如图二所示，包括：①培养基；②细胞的生理状态；③环境因素；④感染参数等。这些环节都应该是培养基设计时候应该考虑的问题，只有把这些因素进行综合优化，才能确保疫苗生产的高效性。

图二：影响细胞病毒产量的因素

病毒侵染细胞首先是病毒的特定表面信号与细胞表面的受体结合，其次病毒的遗传物质进入到细胞内复制，最后是病毒的组装和释放。病毒会以出芽方式或者裂解细胞方式进行释放（图三）。在一些疫苗生产中，病毒就被释放到培养基当中。影响这一过程的因素，主要包括：病毒、细胞和培养基。对于细胞来说，细胞周期对病毒感染也是一个重要因素，例如有报道称FMDV（口蹄疫病毒）更容易感染G1期或者G1/S期的细胞（ClaudiaDOEL, et al,2014）。因此，一个细胞处于什么样的细胞周期，可能会对病毒产量造成影响。病毒无论是以裂解方式或者出芽方式释放，都会直接进入培养基。对于培养基来说，就得保证病毒在培养基当中的完整性，这也是影响疫苗整体质量非常重要的一个因素。细胞裂解后会有很多酶类释放到培养基当中，如：半胱氨酸酶等，这些酶可能会对抗原完整性有一定影响。通过培养基中添加一些物质，来保护抗原物质完整性，也是非常重要的考虑因素。

图三：病毒增殖示意图

此外，细胞在生长阶段和病毒表达阶段的物质需求不同。在细胞生长阶段，培养基设计时应该着重考虑细胞增殖和细胞性能。而在病毒生产的时候，则会倾向于病毒在宿主细胞中的表达数目、抗原的稳定性和完整性。此外，细胞生长阶段培养基中的一些代谢物和一些大分子成分也会对后期病毒纯化造成不利影响。因此，一些生产流程在细胞生长阶段和病毒生产阶段会采取换液方式进行（如图四所示）。这样使得细胞培养和细胞产毒时培养基进行区分。这类生产方式可能更有利于疫苗生产。金源康生物工程有限公司针对口蹄疫疫苗生产，有专门抗原生产的培养基，即：FMD抗原增强培养基。

图四：BHK-21悬浮细胞生产FMD疫苗流程图（包含换液环节）(Radlett，1987)

疫苗生产过程涉及环节较多，不光只有细胞和培养基是主要因素，其他环节也非常重要。只有这些环节整体有机衔接起来，才能确保疫苗生产稳定与高效进行。

参考文献：

§ P.J. Radlett. The use of BHKsuspension cells for the production of foot and mouth diseasevaccines. 1987. Advance in BiochenmicalEngineering/Biotechnology,34:129-146

§ ClaudiaDOEL, et al.Dynamics of foot-and-mouth disease virus replication in cells atdifferent phases of the cell-division cycle.2014,Front.Agr. Sci. Eng. 2014, 1(3): 250–257